BAGAIMANA CARA MENENTUKAN AFINITAS PENGIKATAN DENGAN MENGGUNAKAN MICROPLATE READER?
by Admin
Posted on 2021-09-14 07:47:24
26 April 2021
Banyak proses biologis didorong oleh interaksi dua molekul. Reaksi enzimatik, pengikatan protein protein, replikasi DNA atau interaksi reseptor-ligan hanyalah beberapa contoh yang pasti bergantung pada kedekatan dua pasangan pengikat dan afinitas pengikatannya satu sama lain. Untuk menginduksi efeknya, obat sering secara khusus dirancang untuk menargetkan interaksi molekuler yang terkait dengan penyakit tertentu. Oleh karena itu, di bidang penelitian farmasi, dan penemuan obat, penentuan dan optimalisasi afinitas pengikatan sangat penting untuk pengembangan obat baru dan pilihan pengobatan.
APA ITU AFINITAS YANG MENGIKAT?
Afinitas pengikatan adalah kekuatan interaksi pengikatan antara biomolekul dengan ligan atau pasangan pengikatnya. Interaksi antarmolekul ini sering difasilitasi oleh cara non-kovalen seperti ikatan hidrogen, interaksi elektrostatik, hidrofobik dan gaya Van der Waals.
PENTINGNYA AFINITAS PENGIKATAN DALAM PENEMUAN OBAT DAN PENELITIAN DASAR
Afinitas pengikatan memainkan peran penting dalam penelitian dasar, serta dalam pengobatan modern dan penemuan obat 1,2,3. Karena fungsinya sebagai faktor penentu dalam banyak interaksi biologis, sering diselidiki dalam penelitian terkait. Dari penentuan karakteristik pengikatan antibodi, asam nukleat atau protein, karakterisasi substrat dan inhibitor hingga penemuan mitra interaksi endogen baru, afinitas pengikatan memiliki banyak kegunaan.
Dalam penelitian obat, digunakan sebagai ukuran kualitas calon obat. Pengetahuan tentang afinitas obat potensial terhadap struktur targetnya memungkinkan untuk menarik kesimpulan tentang selektivitas, potensi, dan dosis optimalnya. Secara umum, semakin tinggi afinitas obat terhadap targetnya, semakin baik, karena jumlah obat yang lebih rendah cukup untuk menginduksi efek yang diinginkan, mengurangi risiko efek samping yang merugikan.
BAGAIMANA CARA MENENTUKAN AFINITAS YANG MENGIKAT?
Biasanya, afinitas pengikatan diwakili oleh konstanta disosiasi kesetimbangan KD, konsentrasi ligan di mana setengah situs pengikatan pada biomolekul ditempati pada kesetimbangan. Nilai KD menggambarkan kecenderungan suatu kompleks (BL) untuk berdisosiasi menjadi komponen aslinya (B dan L), dalam hal ini biomolekul dan pasangan pengikatnya. Semakin besar afinitas pengikatan ligan ke targetnya, semakin kecil kecenderungannya untuk berpisah darinya. Dengan demikian, nilai KD yang rendah dikaitkan dengan afinitas pengikatan yang tinggi, dan sebaliknya.
Perhitungan afinitas ikatan berdasarkan konstanta laju kon dan koff
Seperti kebalikannya, konstanta asosiasi KA, KD dapat dihitung dengan menggunakan konstanta laju kon dan koff. Dalam reaksi kesetimbangan pembentukan dan disosiasi kompleks, kon adalah laju pembentukan kompleks BL dari biomolekul B dan ligan L. Dengan demikian, kon adalah konsentrasi B dan L, serta waktu, dan bergantung pada konsentrasi B dan L. diukur dalam per molar per detik (M-1 s-1). Sebaliknya, koff, laju di mana kompleks BL terdisosiasi menjadi B dan L tidak bergantung pada konsentrasi dan diukur dalam per detik (s-1).
Konstanta disosiasi KD dapat dihitung dengan membagi koff dengan kon. Karena mewakili konsentrasi ligan, diukur dalam molaritas (M). Atau, nilai KD juga dapat dihitung dari konsentrasi biomolekul B, ligan L dan kompleks BL pada kesetimbangan
PENENTUAN GRAFIS DARI AFINITAS PENGIKATAN BERDASARKAN KURVA SATURASI
Selain perhitungan matematis, KD dapat ditentukan dengan regresi non-linier dari kurva saturasi. Karena mewakili konsentrasi ligan di mana setengah situs pengikatan ligan dari biomolekul ditempati pada kesetimbangan, nilai KD dapat diturunkan dari grafik pengikatan saturasi dengan memplot persentase biomolekul yang ditempati di atas konsentrasi ligan (gbr. 1).
Gambar 1: Penentuan nilai KD secara grafis untuk ligan yang berbeda.
PENENTUAN AFINITAS PENGIKATAN BERDASARKAN UJI PENGIKATAN KOMPETISI
Atau, nilai KD dapat ditentukan dengan uji pengikatan kompetisi. Di sini, ligan potensial yang tidak ditandai ditambahkan dalam konsentrasi yang meningkat ke biomolekul targetnya yang diperlakukan dengan reagen yang dikenal dan ditandai. Bergantung pada afinitas pengikatannya ke biomolekul target, ligan yang tidak ditandai menggantikan reagen yang ditandai (kompetisi) yang menghasilkan penurunan sinyal. Dengan menggunakan persamaan Cheng-Prusoff, nilai KD dari ligan yang tidak ditandai dapat dihitung dari nilai IC50-nya. 4
Dimana IC50 adalah jumlah ligan yang tidak ditandai yang menggantikan 50% reagen yang diberi tag dari biomolekul target; [T] adalah konsentrasi reagen yang ditandai; dan KDT adalah konstanta disosiasi kesetimbangan dari reagen yang ditandai dan kompleks biomolekul target.
PENGGUNAAN PEMBACA LEMPENG MIKRO DALAM PENENTUAN AFINITAS PENGIKATAN
Pembaca lempeng mikro adalah alat penting dalam mengikat penelitian terkait afinitas. Dengan volume sampel yang lebih kecil, waktu evaluasi yang singkat, dan kemampuan untuk menyelidiki berbagai kondisi dalam satu uji coba, format pengujian berbasis lempeng mikro mendukung proses peningkatan, yang memungkinkan penentuan afinitas pengikatan dan identifikasi mitra interaksi dan obat potensial dalam throughput tinggi .
Selain itu, pembaca pelat mikro memberikan hasil yang kuat dan dapat direproduksi dan dapat dengan mudah diintegrasikan ke dalam sistem otomatis, yang menjadikannya platform yang ideal untuk integrasi dalam fasilitas throughput tinggi. Ada sejumlah besar metode yang dapat digunakan dalam penyelidikan afinitas yang mengikat. Teknik pengukuran berbasis lempeng mikro yang paling relevan yang digunakan untuk menentukan afinitas pengikatan dijelaskan di bawah ini. Ini menggunakan berbagai mode deteksi, dari absorbansi, AlphaScreen®, intensitas fluoresensi, fluoresensi yang diselesaikan dengan waktu (termasuk TR-FRET) dan polarisasi fluoresensi hingga pendaran.
UJI FRET
FRET (Förster´s resonansi energi transfer) adalah teknologi deteksi yang menunjukkan transfer energi antara dua fluorofor, satu donor dan satu akseptor, melekat pada dua mitra interaksi yang menarik dan dengan demikian memungkinkan untuk mempelajari interaksi molekul. Paling umum, protein fluoresen yang dikodekan secara genetik seperti protein fluoresen hijau, merah, atau kuning digunakan sebagai apa yang disebut 'pasangan FRET' untuk menyediakan fluorofor donor dan akseptor.
FRET dinamai ilmuwan Jerman Theodor Förster yang awalnya mengembangkan teori transfer energi resonansi 5. Agar dapat terjadi, fluorofor donor yang telah menyerap energi pada eksitasi eksternal dan menemukan dirinya dalam keadaan tereksitasi elektronik, harus mentransfer energi ke fluorofor akseptor, yang hanya dapat terjadi jika berada dalam jarak dekat (gbr. 2). Transfer energi mengurangi intensitas emisi donor sambil meningkatkan intensitas emisi akseptor yang berfungsi sebagai pembacaan pengujian. Oleh karena itu, dua saluran emisi terpisah diperlukan untuk memantau emisi donor dan akseptor secara bersamaan.
Gambar 2: contoh uji FRET dengan pasangan CFP dan YFP. A) Representasi skematis FRET: jika tidak ada interaksi, CFP tereksitasi dan memancarkan cahaya pada panjang gelombang tertentu. B) Dalam hal interaksi dan FRET terjadi, YFP tambahan memancarkan cahaya pada panjang gelombang yang berbeda, dan intensitas emisi CFP dipadamkan.
Karena akseptor fluorofor hanya memancarkan sinyal jika terjadi pengikatan antara dua mitra interaksi yang diinginkan, fluorofor dapat digunakan untuk menyelidiki interaksi dan afinitas pengikatannya. Dalam konteks ini, sistem uji FRET sering digunakan oleh industri farmasi untuk menyaring kandidat obat baru. Umumnya, pengaturan kompetitif digunakan untuk menghindari kebutuhan untuk memberi label sejumlah besar inhibitor potensial sebelum penyaringan. Di sini, alih-alih inhibitor potensial, struktur target yang sesuai diberi label dengan fluorofor: target yang mengandung donor dan pengikat target yang diketahui mengandung molekul akseptor.
Jika suatu senyawa menggantikan molekul berlabel akseptor, sinyal akseptor berkurang karena pemisahan, yang menandakan penghambatan pengikatan. Afinitas pengikatan kemudian dapat ditentukan dari rasio emisi akseptor terhadap donor. Dengan cara ini, perpustakaan senyawa besar dapat disaring untuk mengikat afinitas ke biomolekul target dengan cara yang cepat dan efisien.
TR-FRET
Time-resolved FRET (TR-FRET) meningkatkan teknologi deteksi FRET dengan memperkenalkan time-resolved fluorescence (TRF) dan deteksi waktu-tunda. Metode ini menghilangkan kebisingan latar belakang berumur pendek yang dapat berasal dari cahaya eksitasi yang tersebar dan autofluoresensi dengan menggunakan lantanida sebagai molekul donor. Fluorofor berumur panjang ini memiliki pergeseran Stokes yang besar dan masa emisi hingga milidetik panjangnya (dibandingkan dengan mikrodetik fluorofor klasik), memungkinkan penerapan waktu tunda antara eksitasi dan deteksi fluoresensi dalam rentang mikrodetik.
Dengan cara ini, interferensi buffer atau medium berkurang secara signifikan oleh emisi fluoresensi berumur panjang dari lantanida dan dengan deteksi rasiometrik dari dua panjang gelombang emisi donor dan akseptor (gbr. 3). Karena sifat-sifat ini, TR-FRET menawarkan peningkatan stabilitas dan spesifisitas dibandingkan FRET standar dan dapat dengan mudah diadaptasi untuk pengujian berbasis sel dan/atau penyaringan throughput tinggi.
Gambar 3: representasi skema dari sinyal yang dipancarkan dalam TR-FRET. Denyut eksitasi segera diikuti dengan penundaan waktu, yang memungkinkan fluoresensi jangka pendek yang mengganggu (berasal dari senyawa, protein, medium) membusuk. Sinyal interaksi kemudian diukur untuk jendela waktu tertentu.
Prinsip umum bagaimana teknologi ini diterapkan, sangat mirip di seluruh produsen kit yang berbeda, yang paling populer termasuk HTRF®, LANCE® dan LanthaScreenTM. Donor dan akseptor terikat secara kovalen dengan mitra yang berinteraksi atau antibodi spesifik terhadap masing-masing dari dua target (atau tag) diberi label dengan donor atau akseptor.
Keuntungan utama dari metode ini adalah bahwa deteksi interaksi intramolekul tidak memerlukan pemisahan fisik dari komponen yang tidak terikat karena sinyal latar belakang dikurangi dengan deteksi waktu tunda. Seperti yang disebut pengujian homogen, pengujian TR-FRET tidak memerlukan di antara langkah pencucian dan dapat dijalankan sebagai pengujian tambah-dan-baca yang sederhana, meminimalkan langkah penanganan dan menjadi lebih nyaman dan lebih sedikit memakan waktu daripada ELISA. Dengan demikian, TR-FRET dapat dengan mudah diadaptasi untuk analisis throughput tinggi dari agregasi protein atau interaksi protein protein. Untuk informasi lebih lanjut, lihat juga: AN 286: Deteksi agregasi protein tau manusia, dan AN 335: Analisis kinetika pengikatan dengan HTRF.
TES POLARISASI FLUORESENSI
Polarisasi fluoresensi (FP) adalah metode deteksi berbasis fluoresensi yang banyak digunakan untuk menyelidiki interaksi molekuler dan afinitas ikatan dalam larutan. Namun, berbeda dengan intensitas fluoresensi, FP tidak hanya fokus pada panjang gelombang emisi fluorofor saat eksitasi tetapi juga pada analisis polarisasi cahaya yang dipancarkan.
Sebagai gelombang elektromagnetik, medan listrik cahaya berosilasi tegak lurus terhadap arah rambat, menentukan polarisasinya. Dalam kasus cahaya tak terpolarisasi arah osilasi ini berfluktuasi secara acak dalam waktu. Dengan menggunakan filter tertentu, osilasi dapat dipilih, sehingga semua gelombang cahaya yang dipilih akan berosilasi dalam satu bidang, menghasilkan cahaya terpolarisasi bidang (gbr. 4).
Gambar 5: Cahaya eksitasi terpolarisasi didepolarisasi oleh molekul-molekul kecil yang berputar cepat yang terikat pada fluorofor. Kompleks yang lebih besar berputar lebih lambat dan karenanya memancarkan cahaya terpolarisasi.
FP dapat digunakan untuk menganalisis interaksi molekuler dan untuk menentukan afinitas pengikatan dengan melakukan kinetika pengikatan. Atau, tes disosiasi dan degradasi enzimatik dapat diukur dengan FP, memanfaatkan penurunan volume molekul dan peningkatan selanjutnya dalam cahaya terdepolarisasi sebagai pembacaan.
Dengan menggunakan prinsip ini, interaksi faktor transkripsi p53 dengan sekuens DNA yang berbeda diukur dengan menggunakan p53, DNA berlabel fluoresen dan sekuens DNA pesaing tanpa fluorofor yang terpasang. Dalam percobaan titrasi, DNA pesaing menggantikan DNA berlabel dari p53 dan perubahan selanjutnya dalam FP DNA berlabel digunakan untuk menghitung konstanta disosiasi KD. Anda akan menemukan informasi lebih lanjut tentang topik ini di AN 180: Pengukuran DNA protein throughput tinggi menggunakan anisotropi fluoresensi. Lihat juga AN 256: Pengukuran pengikatan ligan protein menggunakan polarisasi fluoresensi.
UJI BRET
Uji BRET (bioluminescence resonance energy transfer) adalah metode berbasis pendaran yang dapat digunakan untuk menentukan afinitas pengikatan dan sering digunakan untuk menyelidiki interaksi protein protein. Seperti FRET, mereka didasarkan pada transfer energi resonansi, tetapi dalam kasus BRET, energi donor dihasilkan oleh bioluminesensi dengan satu pasangan interaksi yang digabungkan ke luciferase dan yang lainnya ke akseptor fluorofor. Setelah interaksi kedua pasangan energi pendaran yang dihasilkan oleh luciferase ditransfer ke molekul akseptor dan emisi akseptor dapat diukur (gbr. 6 A).
Afinitas pengikatan ligan ke mitra interaksinya dapat ditentukan dengan uji pengikatan saturasi atau kompetisi dari rasio BRET mentah akseptor terhadap emisi donor (gbr. 6 B). Untuk tujuan ini, para peneliti di Promega mengembangkan luciferase rekayasa genetika yang disebut NanoLuc® (Nluc), yang cocok untuk bertindak sebagai donor BRET karena ukurannya yang kecil dan stabilitasnya yang tinggi 6. Lihat juga: AN 287: Uji NanoBRET untuk pemantauan ligan mengikat GPCR dalam sel hidup, menggunakan CLARIOstar dan PHERAstar FS.
Gambar 6: Prinsip pengukuran BRET untuk mempelajari ikatan ligan
UJI ALPHASCREEN
AlphaScreen® (ALPHA for Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay) menggunakan kimia berbasis manik untuk mempelajari interaksi antarmolekul. Untuk tujuan ini, ligan dan biomolekul target diberi label dengan salah satu dari dua jenis manik-manik berlapis hidrogel, yang disebut manik-manik donor atau akseptor.
Manik donor AlphaScreen mengandung fotosensitizer yang mengubah oksigen (O2) menjadi oksigen singlet tereksitasi (1O2) pada eksitasi pada 680 nm. Pada gilirannya, 1O2 bereaksi dengan pewarna kimia dalam manik-manik akseptor. Transfer energi kimia menghasilkan emisi cahaya yang luas dari 520 nm hingga 620 nm yang dapat diukur dengan pembaca lempeng mikro.
Karena waktu paruh yang pendek dari 1O2 tereksitasi (4 µs), transfer energi dan chemiluminescence hanya dapat terjadi jika kedua jenis manik-manik berada di dekat satu sama lain. Oleh karena itu, pengujian AlphaScreen sangat cocok untuk memantau interaksi mitra pengikat potensial.
Teknologi AlphaScreen, yang mencakup pengujian AlphaScreen, AlphaLISA®, dan AlphaPlex™, terutama digunakan dalam pengujian skrining throughput tinggi untuk menilai interaksi biomolekuler karena sensitivitasnya yang sangat tinggi. Mempekerjakan prinsip ini, Christott et al. menggunakan uji AlphaScreen untuk menyaring inhibitor selektif dari domain YEATS manusia dan menentukan afinitas pengikatannya dengan menganalisis kurva respons dosis dan nilai IC50. Untuk informasi lebih lanjut, lihat: AN 320: PHERAstar mengukur uji AlphaScreen untuk mengembangkan inhibitor selektif untuk domain YEATS manusia.
METODE BERBASIS ABSORBANSI
Sementara metode berdasarkan AlphaScreen, BRET, FP atau FRET paling sering digunakan dalam studi pengikatan, ada juga beberapa tes yang menggunakan absorbansi sebagai pembacaan untuk menyelidiki interaksi molekul dan afinitas pengikatan. Ini didasarkan pada kuantifikasi sinyal absorbansi atau perubahannya dari waktu ke waktu.
Misalnya, uji ELISA kompetitif dapat digunakan untuk menentukan afinitas pengikatan pasangan antibodi. Namun, prinsip yang seringkali heterogen dari jenis pengujian ini membatasi penerapannya dalam pengaturan throughput tinggi otomatis, karena langkah pencucian dan penanganan tambahan diperlukan dibandingkan dengan aplikasi BRET, FRET, TR-FRET atau FP yang homogen.
KESIMPULAN
Pembaca lempeng mikro modern menawarkan beberapa keuntungan untuk penentuan afinitas pengikatan dan uji interaksi seperti peningkatan kinerja dan sensitivitas. Mereka memberikan hasil yang kuat, ditambah dengan variabilitas minimal dan jendela pengujian yang lebih besar. Fitur-fitur seperti Emisi Ganda Simultan, Pemantauan Kurva Peluruhan, Rentang Dinamis yang Ditingkatkan, dan peningkatan deteksi fluorofor dalam rentang merah membantu mengurangi sinyal latar belakang dan waktu pengukuran lebih lanjut sekaligus meningkatkan sensitivitas.
Selain itu, pembaca lempeng mikro adalah platform yang sempurna untuk penyaringan interaksi molekuler, pengikatan protein protein, dan interaksi obat dengan throughput tinggi. Pengujian interaksi homogen, seperti metode berbasis AlphaScreen, BRET, FP, FRET, dan TR-FRET, tidak memerlukan langkah pencucian untuk menghilangkan komponen yang tidak terikat dari pengujian Anda dan didasarkan pada prinsip campuran dan baca. Ini dapat meminimalkan keduanya, langkah penanganan dan waktu operasi, yang mendorongnya terutama dalam penyaringan yang didukung otomatisasi dan di bidang penemuan obat.
Apakah Anda memiliki pertanyaan tambahan terkait dengan aplikasi afinitas yang mengikat? Jangan ragu untuk menghubungi dukungan aplikasi BMG LABTECH di apps@bmglabtech.com untuk informasi tambahan tentang masalah ini.
REFERENSI:
- Kozlov, A.G. et al. SSP-DNA binding monitored by fluorescence intensity and anisotropy. Methods Mol. Biol. 922, 55-83 (2012)
- Gromiha, M.M. et al. Protein-protein interactions: scoring schemes and binding affinity. Curr. Opin. Struct. Biol. 44, 31-38 (2016)
- Bee, C. et al. Determining the Binding affinity of Therapeutic Monoclonal Antibodies towards Their Native Unpurified Antigens in Human Serum. PLOS ONE 8(11), e80501 (2013)
- Cheng, Y.C.; Prusoff, W.H. Relationship between the inhibition constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (IC50) of an enzyme reaction. Biochem. Pharmacol. 22, 3099-108 (1973)
- Förster, T. Energy migration and fluorescence. J. Biomed. Opt. 17, 1 (2012)
- Hall, M.P. et al. ACS Chem. Biol. 7, 1848–1857 (2012)