CARA MENGOPTIMALKAN
by Admin
Posted on 2022-02-07 09:26:03
Meskipun konsep keuntungan fluoresensi selalu sulit dipahami, itu adalah parameter make-or-break dalam pembacaan microplate. Bahkan, pengaturan gain yang salah dipilih dapat menyebabkan saturasi atau data berkualitas buruk.
Dr Tobias Pusterla
PhD, International Marketing Manager
BMG LABTECH HQs
DAFTAR ISI:
• Apa keuntungan fluoresensi?
• Menyesuaikan keuntungan fluoresensi pada microplate reader
• EDR membuat penyesuaian keuntungan fluoresensi berlebihan
Keuntungan fluoresensi mungkin adalah parameter pengukuran yang paling misterius yang dihadapi pengguna microplate reader. Jika Anda seorang audiophile atau musisi, Anda mungkin cukup akrab dengan konsep keuntungan. Namun, bagi pengguna microplate reader, sementara parameter seperti eksitasi dan panjang gelombang emisi atau jumlah kilatan cukup jelas, keuntungan selalu sulit dipahami. Terlepas dari kenyataan ini, ini adalah pengaturan make-or-break, karena keuntungan fluoresensi yang salah dipilih dapat membuat data Anda tidak dapat digunakan.
Pada microplate reader, intensitas fluoresensi (FI) terdeteksi oleh tabung photomultiplier (PMT). PMT mengalikan sinyal cahaya yang masuk dari sampel menggunakan efek fotolistrik dan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik. Hal ini kemudian diukur oleh microplate fluoresensi di Relative Fluorescence Units (RFU).
Karena tidak ada PMT standar atau skala RFU standar, jumlah absolut tidak dapat dibandingkan antara pembaca produsen yang berbeda. Dengan demikian, tidak seperti absorbansi, FI bukanlah pengukuran mutlak. Selain itu, intensitas sinyal fluorescent biasanya relatif terhadap pengukuran lain, pengukuran refence atau pengaturan gain.
APA KEUNTUNGAN FLUORESENSI?
Keuntungan fluoresensi didefinisikan sebagai tegangan PMT di mana sinyal fluorescent yang masuk diperkuat. Oleh karena itu, dapat dilihat sebagai faktor amplifikasi yang memungkinkan untuk memberikan resolusi data yang lebih baik.
Rentang dinamis yang dengannya sampel terdeteksi didefinisikan sebagai rasio antara intensitas paling terang dan paling redup yang dapat diukur oleh microplate reader, dan secara signifikan mempengaruhi output dan kualitas data. Parameter utama yang mempengaruhi rentang dinamis adalah keuntungan fluoresensi.
Bahkan, memodifikasi keuntungan bergerak rentang dinamis deteksi sepanjang kurva konsentrasi tes atau analit. Yang penting, keuntungan fluoresensi tidak mengubah lebar rentang dinamis, hanya posisinya.
Biasanya, nilai keuntungan tinggi memberikan amplifikasi besar dan karenanya cocok untuk sinyal redup. Sinyal yang sangat terang malah membutuhkan keuntungan yang lebih rendah karena amplifikasi sinyal yang lebih sedikit diperlukan (gambar 1).
Gambar 1: nilai gain tinggi meningkatkan sensitivitas, karena memungkinkan membedakan antara sinyal rendah dan kosong, tetapi dapat dengan mudah mengakibatkan overflow jika sinyal yang lebih cerah hadir. Sinyal tinggi memerlukan nilai gain rendah untuk menghindari saturasi detektor, tetapi membatasi sensitivitas karena detektor tidak lagi dapat memisahkan sinyal rendah dari kosong.
Nilai keuntungan fluoresensi yang tidak tepat berdampak negatif terhadap kualitas data, jendela uji dan sensitivitas. Jika sampel terang diukur dengan gain fluoresensi tinggi, ini dapat mengakibatkan saturasi detektor dan data yang tidak dapat digunakan. Sebaliknya, jika sinyal redup terdeteksi dengan keuntungan fluoresensi rendah, mereka mungkin menjadi tidak dapat dibedakan dari kebisingan latar belakang.
MENYESUAIKAN KEUNTUNGAN FLUORESENSI PADA MICROPLATE READER
Untuk menghindari masalah ini dan memberikan rentang dinamis terbaik antara nilai pengukuran tertinggi dan terendah dari tes Anda, gain fluoresensi biasanya disesuaikan pada sampel dengan output sinyal tertinggi yang diharapkan (misalnya, kontrol positif).
Pada microplate reader, keuntungan dapat ditentukan secara empiris atau dapat disesuaikan secara otomatis. Penentuan empiris bergantung pada trial and error, atau pada nilai keuntungan fluoresensi yang telah ditentukan sebelumnya yang didefinisikan oleh produsen microplate reader untuk uji komersial tertentu.
Metode sebelumnya menyediakan parameter yang dibuat khusus untuk uji tertentu tetapi menyiratkan pengeluaran waktu dan biaya, karena tergantung pada sifat uji atau kit, pengukuran harus diulang beberapa kali untuk mengidentifikasi nilai keuntungan fluoresensi yang menghindari saturasi tetapi masih mencakup rentang dinamis uji yang baik. Metode yang terakhir, memberikan pendekatan yang lebih aman tetapi biasanya tidak fleksibel dan, tergantung pada tes yang akan diukur, cukup membatasi.
Semua microplate reader BMG LABTECH dapat secara otomatis menentukan keuntungan fluoresensi, asalkan disediakan well khusus dengan intensitas sinyal tertentu yang diidentifikasi. Penyesuaian gain otomatis melibatkan pemindaian pra-pengukuran sampel Anda.
Kami biasanya merekomendasikan untuk menjalankan penyesuaian keuntungan otomatis pada kapasitas 90% pada sampel di mana sinyal terkuat diharapkan. Sisanya 10% akan memberi Anda sedikit buffer jika Anda memiliki replikasi dengan intensitas sinyal yang sedikit berbeda. Jika sampel dengan sinyal terkuat tidak diketahui dan / atau kontrol positif tidak tersedia, pengguna dapat menjalankan penyesuaian gain otomatis pada kapasitas 10% pada kontrol kosong atau negatif. Namun, pendekatan ini tidak dapat menghindari saturasi, tergantung pada sampel.
EDR MEMBUAT PENYESUAIAN KEUNTUNGAN FLUORESENSI BERLEBIHAN
Pada CLARIOstar Plus, penyesuaian keuntungan fluoresensi tidak lagi diperlukan. Teknologi Enhanced Dynamic Range (EDR) dirancang khusus untuk menawarkan rentang dinamis terbesar yang mungkin - 8 dekade konsentrasi, membuat penyesuaian keuntungan berlebihan. Dengan EDR, hasil yang sangat andal dapat diukur melalui rentang dinamis yang besar tanpa intervensi manual.
EDR sangat bermanfaat saat menjalankan uji kinetik. Dalam seperti tes intensitas sinyal biasanya membangun dari waktu ke waktu, membuat penyesuaian keuntungan fluoresensi pada deteksi rumit (gambar 3). Aplikasi praktis dari prinsip ini ditunjukkan dalam catatan aplikasi 'CLARIOstar Plus menyederhanakan pemantauan reaksi enzimatik dengan teknologi Enhanced Dynamic Range (EDR) barunya'
Gambar 3: skema dari uji kinetik terdeteksi dengan keuntungan tetap (garis abu-abu) atau dengan EDR (garis ungu). Tergantung pada penumpukan sinyal selama reaksi kinetik, tes dapat dengan mudah menjenuhkan detektor. Dengan rentang dinamis 8 dekade konsentrasi, EDR secara signifikan mengurangi masalah ini.
Keuntungan lain dari EDR adalah memungkinkan untuk membandingkan data dari uji yang berbeda berjalan yang telah diukur dengan kit assay yang sama pada titik waktu yang berbeda. Meskipun intensitas fluoresensi tidak menjadi pengukuran mutlak, ini dimungkinkan karena skala deteksi yang sama digunakan untuk semua pengukuran, asalkan kondisi uji yang sama, jenis pelat dan pengaturan deteksi diterapkan.